¿Cómo se secuencían las muestras? Entrevista a Núria Andreu de la Unidad de Genómica del CRG

Nuria Andreu es bióloga, y trabaja en la Unidad de Genómica del CRG. Forman el equipo 5 técnicos más y una bioinformática.

Su Unidad ofrece servicio a los proyectos científicos sobre las tecnologías de microarrays (para el análisis de perfiles de expresión y variaciones estructurales a nivel genómico) y de Next Generation Sequencing, técnicas para generar librerías (fragmentos de DNA capaces de ser leídos en el secuenciador) y llevar a cabo la secuenciación (.

En el caso del proyecto de SacaLaLengua, la unidad se ha encargado de la secuenciación de las bacterias presentes en las salivas: para ello han realizado las librerías de DNA y las han secuenciado utilizando el secuenciador de Illumina MiSeq.

¿Cómo explicarías, paso a paso, vuestro trabajo con las muestras?
Lo primero que hacemos con las placas que recogen el DNA extraído (paso que anteriormente os explicó Miriam) es cuantificar estos DNAs, ya que la extracción no habrá funcionado igual con todas las muestras (diferente volumen de saliva, diferente cantidad de microbios presentes en la boca,…).

Una vez sabemos qué cantidad hay de DNA en cada pocillo de las placas (son 12 placas en total), preparamos una nueva placa con la misma cantidad de DNA en cada pocillo: estás son las placas que llamamos de DNA normalizadas (porque todos los pocillos tienen la misma cantidad de DNA).

Posteriormente, hacemos una primera PCR (PCR=polymerase chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa) con cebadores específicos de bacterias, para amplificar una región del gen ribosomal 16S (presente en el DNA bacteriano, pero no en el DNA humano). En este caso, vamos a amplificar (o sea hacer copias) una región concreta del genoma bacteriano (es decir, sólo vamos a mirar las bacterias que hay en la saliva, no el DNA humano).

Después purificamos estos productos de PCR (llamados amplicones) con unas bolitas magnéticas. Y hacemos una segunda PCR, en la que vamos a acabar de introducir las regiones necesarias para poder secuenciar. Estas regiones se llaman adaptadores e índices. Los adaptadores son fragmentos de DNA que van a reconocer los fragmentos de DNA que se encuentran en la superficie física donde se hace la reacción de secuenciación. Los índices, en cambio, son secuencias de 8 letras que nos van a permitir etiquetar el DNA de cada pocillo para poder identificarlos luego y saber de quién es cada secuencia que estamos leyendo.

Finalmente, juntamos las muestras de 2 placas de 96 pocillos, es decir, 192 muestras, en un único tubo. Y este conjunto de muestras es el que se introduce en el secuenciador MiSeq. En él, se leen en paralelo millones de secuencias de las diferentes bacterias presentes en la saliva de los individuos que estamos analizando. Posteriormente, el software de análisis del MiSeq asignará cada lectura a una persona en concreto, gracias a los índices que habíamos introducido en nuestra segunda PCR.

Pues parece un proceso largo y laborioso…
Sí, lo es, pero cabe destacar que en esta segunda edición hemos puesto a punto los diferentes pasos de preparación de las librerías en un robot de pipeteo y esto nos ha permitido ganar mucho tiempo y ser más sistemáticos (además que mi espalda también ha salido ganando).

Por ejemplo, antes en un día preparaba la PCR de dos placas, ahora con el robot, en un día, preparo 4, de hecho, podría hacerlas todas en un día, si no fuera porque no tengo máquinas de PCR suficiente para ello. La normalización de las placas de DNA antes las realizábamos a un ritmo de 1 día para 2 placas, mientras ahora en 2 días, hemos cuantificado y normalizado 10 placas.

¿Y esto se traduce también en menos cantidad de residuos producidos?
En realidad, no: seguimos gastando muchas puntas de plástico. Esto es así por el hecho de procesar tantas muestras, y porque las técnicas de biología molecular necesitan de unas condiciones de limpieza extremas, para no contaminar las muestras con las que estamos trabajando de nuestro propio DNA o de los microbios que podamos tener nosotros o bien el laboratorio.

Mientras he estado contigo viendo cómo trabajabas, me ha sorprendido ver la cantidad de pasos para que, al final, todo acabe ¡en un único eppendorf!
Efectivamente. Y cada paso es muy importante. Empezamos trabajando con placas de 96 pocillos, de hecho, trabajamos siempre en paralelo con 2 placas a la vez, es decir, 188 muestras de DNA de saliva, y 4 controles que usamos en todo el proceso. I finalmente, mezclamos estas 192 muestras en un único tubo eppendorf, y esto es lo que secuenciamos.

Pero ¿cómo podéis leer el DNA de todas estas muestras a la vez y saber de quién es?
Pues gracias a las secuencias índices que hemos introducido en la segunda PCR. Estos índices no son más que unas secuencias de 8 letras que se van a leer en el secuenciador también, y nos va a permitir relacionar cada secuencia bacteriana con la saliva de la que provenía.

¿Y cómo sabéis seguro que es el DNA de las bacterias?
En la saliva tenemos células muy diferentes, de la persona, de bacterias, de hongos, de virus… al extraer el DNA celular estamos obteniendo el de todas las células presentes en la muestra de saliva (sean humanos o microbianos). Pero a nosotros solo nos interesa el contenido en microbios de la saliva, por eso, hacemos una PCR que es específica de bacterias, y sólo vamos a amplificar una región pequeña del DNA de las bacterias, y no de otro organismo. Así que no podemos decir nada sobre el DNA humano de cada muestra, porque toda la información que sacamos es específica para bacterias.

A nivel personal, qué dirías que te ha aportado este proyecto…

Muchas cosas. Nuevos retos, por ejemplo. Decidimos acercar un poco más el laboratorio a los ciudadanos, con lo que tuvimos que poner a punto un método rápido de extracción de DNA de la saliva, PCR de DNA bacteriano (usando la máquina miniPCR), y electroforesis de estos amplicones. Junto con Luis Bejarano preparamos y pusimos a punto todo el equipamiento necesario para poder realizar estas técnicas rutinarias de laboratorio de biología molecular en los diferentes colegios y centros cívicos donde nos lo pidieran. Fue divertido, pero un reto también, porque vi la dificultad de hacer una simple PCR en un sitio diferente al que estás acostumbrado (conexión a Internet que no funciona, aplicaciones que no se descargan, etc).

También he disfrutado mucho del contacto con la gente, durante la Fiesta de la Ciencia de Barcelona explicando el proyecto a los niños, en Institutos con estudiantes de 4r de ESO y también en la radio, donde me estrené en un programa de radio de divulgación científica. Finalmente, también he participado en la co-creación del juego sobre el microbioma, xxx